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    荧光定量PCR具体使用操作步骤简介

    返回列表 来源: 发布日期: 2018.05.25

    操作步骤

    荧光定量PCR 实验步骤:

    折叠样品RNA的抽提

    ①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。

    ②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

    ③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

    ④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。

    ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

    ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

    折叠RNA质量检测

    1)紫外吸收法测定

    先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。

    ① 浓度测定

    A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下:

    RNA溶于40 μl DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495μl的TE中,测得A260 = 0.21

    RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

    取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 μl,剩余RNA总量为:

    35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

    ②纯度检测

    RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。

    2)变性琼脂糖凝胶电泳测定

    ①制胶

    1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

    10×MOPS电泳缓冲液

    浓度 成分

    0.4M MOPS,pH 7.0

    0.1M 乙酸钠

    0.01M EDTA

    灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

    ②准备RNA样品

    取3μgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

    ③电泳

    上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。

    ④紫外透射光下观察并拍照

    28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

    折叠样品cDNA合成

    ①反应体系

    序号

    反应物

    剂量

         1     

                逆转录buffer          

          2μl      

          2      

    上游引物

    0.2μl

    3

    下游引物

    0.2μl

    4

    dNTP

    0.1μl

    5

    逆转录酶MMLV

    0.5μl

    6

    DEPC水

    5μl

    7

    RNA模版   

    2μl

    8

           总体积           

           10μl      


    轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。

    ②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5μl,37℃水浴60分钟。

    ③取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃待用。

    折叠样品
    管家基因(β-actin)实时定量PCR

    ①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为10,反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为10,依次稀释至10、10、10、10、10、10,以备用。

    ②反应体系如下:

    标准品反应体系

    序号

    反应物

    剂量

          1      

         SYBR Green 1 染料      

          10μl      

    2

    阳性模板上游引物F

    0.5μl

    3

                    阳性模板下游引物R                

    0.5μl

    4

    dNTP

    0.5μl

    5

    Taq酶

    1μl

    6

    阳性模板DNA

    5μl

    7

    ddH2O

    32.5μl

    8

            总体积      

             50μl       


    轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。

    管家基因反应体系:

    序号

    反应物

      剂量  

          1       

                     SYBR Green 1 染料                    

        10μl     

    2

    内参照上游引物F

    0.5μl

    3

    内参照下游引物R

    0.5μl

    4

    dNTP

    0.5μl

    5

    Taq酶

    1μl

    6

    待测样品cDNA

    5μl

    7

    ddH2O

            32.5μl      

    8

     总体积

           50μl      


    轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。

    ③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:93℃2分钟,然后93℃ 1分钟,55℃ 2分钟,共40个循环。

    折叠模板

    ①针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

    反应体系:

    序号

    反应物

    剂量

            1       

                           10×PCR缓冲液                     

             2.5 ul         

    2

    MgCl2溶液

    1.5 ul

    3

    上游引物F

    0.5 ul

    4

    下游引物R

    0.5 ul

    5

    dNTP混合液

    3 ul

    6

    Taq聚合酶

    1 ul

    7

    cDNA

    1 ul

    8

    加水至总体积为

    25ul


    轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。

    35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72℃延伸5分钟。

    ②PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

    ③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×10,依次稀释至10、10、10、10、10、10几个浓度梯度。

    折叠PCR

    ①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。

    体系配置如下:

               序号          

                     反应物                 

              剂量          

    1

    SYBR Green 1 染料

    10 ul

    2

    上游引物

    1ul

    3

    下游引物

    1ul

    4

    dNTP

    1ul

    5

    Taq聚合酶

    2ul

    6

    待测样品cDNA

    5ul

    7

    ddH2O

    30ul

    8

    总体积

    50 ul

     

    轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。

    ②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃2分钟预变性,然后按93℃ 1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,最后72℃7分钟延伸。

    折叠引物列表

    引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

    折叠电泳

    各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。



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